肺魚（lungfish）。圖片引自：https://alchetron.com/Lungfish#lungfish-f14c9e39-bfca-4867-82f7-db17f33f4a4-resize-750.png
2021年2月4日，Cell在線發表了題目分別為“Tracing the genetic footprints of vertebrate landing in non-teleost ray-finned fishes”和“African lungfish genome sheds light on the vertebrate water-to-land transition”的兩篇研究論文（圖一、二）。兩項姊妹篇研究分別解析了原始輻鰭魚類塞內加爾多鰭魚、匙吻鱘、弓鰭魚和鱷雀鱔，以及現生肉鰭魚類中與四足動物親緣關系最近的非洲肺魚共五個物種的基因組。兩篇論文交叉整合了基因組學、進化生物學、魚類學、古生物學、計算生物學和實驗生物學等學科，從不同角度和不同演化節點揭示了脊椎動物水生到陸生轉變的遺傳基礎之謎。
原始輻鰭魚類基因組的解析發現登陸的遺傳基礎已經在硬骨魚類祖先出現
在脊椎動物從水生到陸生的演化過程中有許多的障礙需要克服，其中兩個重要問題是如何在缺少水體浮力的情況下支撐身體進行運動，以及如何呼吸空氣中的氧。多鰭魚、鱘魚、弓鰭魚、雀鱔等原始輻鰭魚類，盡管與登陸“先遣隊”親緣關系較遠，但卻保留了一些與克服上述從水到陸障礙有關的特征。特別是多鰭魚，擁有原始的用來呼吸空氣的肺，其中多鰭魚可以在溶氧量極低的水中通過背部的噴水孔吸入空氣，甚至離水存活一段時間。此外，多鰭魚也與空棘魚相似，擁有肌肉和內骨骼支撐的胸鰭柄，可以在水底爬行。這些原始魚類所具有的獨特生物學特性和演化地位吸引著眾多科學家對它們進行研究。第一項研究解析了高質量染色體級別的多鰭魚基因組以及其他三種原始輻鰭魚的基因組，基于這些基因組信息，通過比較分析和實驗驗證，揭示了原始輻鰭魚類中已經演化出的支撐后來肉鰭魚進一步演化到四足動物的遺傳前提基礎。
調節四肢運動靈活性的遺傳基礎
現生物種和滅絕物種的骨骼比較已經知道包括人在內的四足動物的“大臂”(肱骨)與遠古魚類胸鰭的后基鰭骨同源，這塊骨頭在輻鰭魚類的真骨魚(teleost，包括鰻魚、鯉魚、鱸魚等大多數常見魚類)中丟失。在獲得原始輻鰭魚類多鰭魚、匙吻鱘、弓鰭魚和鱷雀鱔的基因組序列后，通過與各種有頜脊椎動物基因組的比較，研究人員發現許多四足動物中調節四肢發育的增強子在原始輻鰭魚類已經存在。其中一個極端保守的增強子甚至可以追溯到軟骨魚類，這一增強子可以調控下游Osr2基因在滑膜關節的表達。Osr2與滑膜關節的形成相關并能增加四肢運動的靈活性。通過對多鰭魚胸鰭再生實驗以及原位表達分析證實了該基因主要在后基鰭骨與鰭條的連接處表達，這一區域對應了四足物種里的滑膜關節結構。而真骨魚類的基因組中則丟失了這一增強子，與此對應，真骨魚類也丟失了后基鰭骨及連接的滑膜關節。這一結果揭示了滑膜關節雛形的遺傳創新在硬骨魚祖先中已經出現，而真骨魚類次生地失去了相應的功能。
空氣呼吸及肺的起源
嗅覺感受器可以感受環境中化學分子的刺激，再將之轉換成嗅神經沖動信息。比較基因組學的深入分析發現在這些遠古魚類的嗅覺感受器中同時存在著兩種類型的嗅覺受體，除了具有魚類都擁有的檢測水溶性分子的嗅覺受體之外，還具有能夠檢測空氣分子的嗅覺受體。這與它們空氣呼吸的能力相一致。此外，通過多器官表達譜的聚類和系統發生關系分析發現肺與魚鰾的表達譜最為接近，一些肺特異性表達的基因也在魚的祖先中已經出現，暗示著“原肺”形成的分子基礎在硬骨魚祖先中已經存在。對多個物種的轉錄組分析顯示，在原始輻鰭魚類肺中高表達的基因顯著富集在血管新生通路，這也解釋了這些原始輻鰭魚類的肺或者魚鰾表面為何密布血管，幫助氧氣在肺部的擴散及運輸。這些結果在遺傳基礎上驗證了達爾文提出的肺和魚鰾是同源器官的假說，也清楚說明，我們常見的真骨魚的魚鰾是由脊椎動物早期的肺演變而來的。
心臟系統演化
脊椎動物演化過程中心臟和呼吸系統的協同演化發揮著重要作用。呼吸系統為正常心臟功能維持提供氧氣，同時依賴心臟將攜帶氧氣的血液運輸到全身。從魚類的一心房一心室再到人的兩心房兩心室，心臟結構趨向于完善，功能也變得更加復雜。動脈圓錐位于心臟流出通道的上部并與右心室接壤，作為心臟活動的輔助器官，它可以防止血液逆流以及平衡心室血壓。原始輻鰭魚類和更早出現的軟骨魚類也存在動脈圓錐這一結構。通過基因組共線性分析，研究發現跟心臟系統相關的基因在人類和多鰭魚之間保留了非常保守的共線性關系，提示這些基因也保留了相當保守的調控機制。這一研究還首次找到了一個調控Hand2基因的保守調控原件。研究人員對小鼠基因組中該調控元件進行靶向刪除，發現新出生的突變小鼠在早期胚胎發育中，由于右心室Hand2基因表達量降低，從而導致心臟發育不全以及先天性死亡。之前有報道稱Hand2基因的功能突變會導法樂氏四聯癥（一種先天心臟缺陷疾病）的發生。該結果將有助于人類對于心臟發育缺陷的研究。
總結
這一研究不僅在分子水平揭示了許多脊椎動物重要器官的同源關系，還揭示了調控這些器官和相關功能的分子遺傳機制。基于物種演化過程的比較分析還首次提出與四足動物陸生適應相關器官和生理功能的遺傳調控機制在其硬骨魚祖先中即已經開始出現雛形。特別是調控空氣呼吸功能、骨骼運動靈活性、以及心肺系統發育相關的古老基因和調控元件為后續肉鰭魚登陸演化出四足動物這一飛躍提供了重要的遺傳創新基礎。
原始輻鰭魚已經具備大量陸生特性相關的關鍵基因組元件
這項研究的通訊作者為張國捷教授（深圳華大基因研究院/中科院昆明動物所/哥本哈根大學）、何舜平研究員（中科院水生所）、朱敏研究員（中科院古脊椎動物與古人類研究所）和王文教授（西北工業大學/中科院昆明動物所），第一作者為畢旭鵬（中科院水生所/深圳華大基因研究院）、王堃（西北工業大學）、楊連東（中科院水生所）、潘海林（深圳華大基因研究院）、姜海峰（中科院水生所）和危起偉（中國水產科學研究院長江水產研究所）。
肺魚基因組的解析及其對四足動物登陸研究的重大啟示
第二項關于脊椎動物水生到陸生演化的工作報道了迄今解析的最大基因組，其大小高達400多億對堿基（40 Gb），是人類基因組大小（3Gb）的10多倍。為高質量解析這一高復雜度巨大基因組，該項目催生了兩個三代測序組裝軟件NextDenovo和wtdbg.2.0，再次彰顯了我國在基因組學研究領域的前沿影響力。最終肺魚組裝結果與預測大小吻合，完整度高達染色體掛載率達到99%以上。該基因組包含了95%以上的脊椎動物完整基因。與此相比，2021年1月在Nature雜志公開的澳洲肺魚基因組組裝大小為34Gb，完成度僅67%的脊椎動物完整基因；2018年2月在Nature雜志公開的美西螈基因組組裝大小為32Gb，完成度僅70%。因此，這項工作所報道的非洲肺魚基因組不僅是目前最大的基因組，也是首個完整且高質量的超大基因組，標志著我國科技人員在超大基因組解析方面已經達到國際頂尖水平。
肺魚基因組的擴增
雖然肺魚基因組是人類10多倍，但基因數目卻與人類差不多，因此肺魚擁有大量超長基因，最長基因長達18Mb，人類最長基因為2.8Mb。研究發現，肺魚這些超長基因表達水平與短基因和其他物種的同源基因近似，提示肺魚演化出了高效轉錄這些超長基因的機制。研究人員發現，肺魚基因組之所以如此龐大，主要是由于轉座子在肺魚演化枝中數億年持續插入的結果。而肺魚基因組之所以能容忍大量的轉座子復制累積“垃圾DNA”可能是因為同時演化出了抑制轉座子在生殖系細胞表達的能力，因為KRAB和zf-C2H2這兩個功能結構域（domain）共同構成的特定鋅指蛋白基因家族在肺魚基因組中大量擴增，其在生殖腺中的表達水平也大大提升。此外，超長基因的長度增長速率也比短基因低，提示肺魚中基因長度的增長速度也受到了自然選擇的控制。這些結果解開了肺魚超大基因組之謎。
抗焦慮能力增強
在脊椎動物水生陸生轉變過程中，大腦中最為顯著的改變在杏仁核區域。杏仁核是負責情緒處理的重要器官。在四足動物中，杏仁核開始具備了分區結構和更為復雜的鏈接。此前也有研究表明，肺魚的杏仁核也可能與四足動物更為類似。本研究發現，在肺魚和四足動物的祖先出現了兩個新基因，Nps和Npsr，分別編碼神經肽S及其受體。已知這兩個基因在杏仁核表達，是負責抗焦慮的重要基因。此外，研究還發現了多個與杏仁核有關的基因在肺魚和四足動物祖先出現了較大的氨基酸改變。這些結果提示肺魚和四足動物的祖先在抗焦慮方面可能具有更強的能力，而這一能力的增強對于脊椎動物登陸可能具有一定的積極作用。
非洲肺魚基因組為理解脊椎動物水生陸生轉變提供了重要橋梁
總結
這項研究表明，脊椎動物從水生到陸生的演化呈現了三步式演化的特征。以空氣呼吸為例，空氣呼吸能力和空氣嗅覺的分子基礎在硬骨魚類共同祖先中已經出現，而真骨魚則丟失了這一特性，屬于更為特化的類群。隨后，肉鰭魚的祖先中出現了更多呼吸相關基因和功能元件，使得它們的空氣呼吸能力進一步加強。最終，四足動物演化出了更多基因和功能元件從而具備了完備的空氣呼吸能力，成功擺脫水的桎梏。對于各種陸生適應性狀相關的遺傳創新分析表明，新基因的起源、新調控元件的出現以及基因編碼氨基酸的改變等三類遺傳創新在脊椎動物水生到陸生的演化過程中都發揮了作用。
這項工作的通訊作者為王文教授（中科院昆明動物所/西北工業大學）、何舜平研究員（中科院水生所）、邱強教授（西北工業大學）和趙文明研究員（中科院北京基因組所），第一作者為王堃（西北工業大學）、王俊（華南農業大學）、朱成龍（西北工業大學）、楊連東（中科院水生所）、任彥棟（西北工業大學）、阮玨（中國農業科學院深圳農業基因組研究所）、范廣益（青島華大基因研究院）和胡江（武漢希望組生物科技有限公司）。
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